Fatturi ta' interferenza fir-reazzjonijiet tal-PCR

Matul ir-reazzjoni tal-PCR, spiss jiltaqgħu ma' xi fatturi li jinterferixxu.
Minħabba s-sensittività għolja ħafna tal-PCR, il-kontaminazzjoni hija kkunsidrata bħala wieħed mill-aktar fatturi importanti li jaffettwaw ir-riżultati tal-PCR u tista' tipproduċi riżultati pożittivi foloz.
Bl-istess mod kritiċi huma d-diversi sorsi li jwasslu għal riżultati foloz-negattivi. Jekk parti essenzjali waħda jew aktar tat-taħlita tal-PCR jew ir-reazzjoni ta' amplifikazzjoni nnifisha jiġu inibiti jew interferiti magħhom, l-analiżi dijanjostika tista' tiġi mfixkla. Dan jista' jwassal għal effiċjenza mnaqqsa u anke riżultati foloz-negattivi.
Minbarra l-inibizzjoni, jista' jseħħ telf tal-integrità tal-aċidu nuklejku fil-mira minħabba l-kundizzjonijiet tat-tbaħħir u/jew tal-ħażna qabel il-preparazzjoni tal-kampjun. B'mod partikolari, temperaturi għoljin jew ħażna inadegwata jistgħu jwasslu għal ħsara liċ-ċelloli u l-aċidi nuklejċi. L-iffissar taċ-ċelloli u t-tessuti u l-inkorporazzjoni tal-paraffina huma kawżi magħrufa sew tal-frammentazzjoni tad-DNA u problema persistenti (ara l-Figuri 1 u 2). F'dawn il-każijiet, anke l-iżolament u l-purifikazzjoni ottimali mhux se jgħinu.

Figura 1 | Effett tal-immobilizzazzjoni fuq l-integrità tad-DNA
L-elettroforesi tal-ġel tal-agarose wriet li l-kwalità tad-DNA iżolat minn sezzjonijiet tal-paraffina tal-awtopsji varjat konsiderevolment. DNA ta’ tulijiet medji differenti tal-frammenti kien preżenti fl-estratti skont il-metodu ta’ fissazzjoni. Id-DNA ġie ppreservat biss meta ġie ffissat f’kampjuni ffriżati nattivi u f’formalina newtrali b’buffer. L-użu ta’ fissattiv Bouin aċiduż ħafna jew formalina li fiha l-aċidu formiku mhux b’buffer irriżulta f’telf sinifikanti ta’ DNA. Il-frazzjoni li jifdal hija frammentata ħafna.
Fuq ix-xellug, it-tul tal-frammenti huwa espress f'pari ta' kilobażi (kbp)

Figura 2 | Telf ta' integrità ta' miri ta' aċidu nuklejku
(a) Vojt ta' 3′-5′ fuq iż-żewġ linji jirriżulta fi ksur fid-DNA fil-mira. Is-sintesi tad-DNA xorta sseħħ fuq il-framment żgħir. Madankollu, jekk sit ta' tgħaqqid tal-primer ikun nieqes fuq il-framment tad-DNA, isseħħ biss amplifikazzjoni lineari. Fl-aktar każ favorevoli, il-frammenti jistgħu jerġgħu jissaturaw lil xulxin, iżda r-rendiment ikun żgħir u taħt il-livelli ta' skoperta.
(b) It-telf ta' bażijiet, prinċipalment minħabba d-depurinazzjoni u l-formazzjoni ta' dimeri tat-timidina, iwassal għal tnaqqis fin-numru ta' bonds tal-idroġenu u tnaqqis fit-Tm. Matul il-fażi ta' tisħin imtawla, il-primers idubu 'l bogħod mid-DNA tal-matriċi u ma jissaddadx anke taħt kundizzjonijiet inqas stretti.
(ċ) Bażijiet tat-timina biswit xulxin jiffurmaw dimeru TT.
Problema komuni oħra li spiss isseħħ fid-dijanjostika molekulari hija r-rilaxx inqas milli ottimali ta' aċidi nuklejċi fil-mira meta mqabbel mal-estrazzjoni tal-fenol-kloroform. F'każijiet estremi, dan jista' jkun assoċjat ma' negattivi foloz. Jista' jiġi ffrankat ħafna ħin permezz ta' lisi bit-togħlija jew diġestjoni enżimatika tad-debris taċ-ċelluli, iżda dan il-metodu spiss jirriżulta f'sensittività baxxa għall-PCR minħabba rilaxx insuffiċjenti ta' aċidu nuklejku.

Inibizzjoni tal-attività tal-polimerażi waqt l-amplifikazzjoni

B'mod ġenerali, l-inibizzjoni tintuża bħala kunċett ta' kontenitur biex tiddeskrivi l-fatturi kollha li jwasslu għal riżultati subottimali tal-PCR. F'sens strettament bijokimiku, l-inibizzjoni hija limitata għall-attività tal-enzima, jiġifieri, tnaqqas jew tipprevjeni l-konverżjoni tas-sottostrat-prodott permezz ta' interazzjoni mas-sit attiv tal-polimerażi tad-DNA jew il-kofattur tagħha (eż., Mg2+ għat-Taq DNA polymerase).
Komponenti fil-kampjun jew diversi buffers u estratti li fihom reaġenti jistgħu jinibixxu direttament l-enzima jew jaqbdu l-kofattori tagħha (eż. EDTA), u b'hekk jinattivaw il-polimerażi u min-naħa tagħhom iwasslu għal riżultati tal-PCR imnaqqsa jew negattivi foloz.
Madankollu, ħafna interazzjonijiet bejn il-komponenti tar-reazzjoni u l-aċidi nuklejċi li fihom il-mira huma wkoll iddeżinjati bħala 'inibituri tal-PCR'. Ladarba l-integrità taċ-ċellula tiġi mfixkla mill-iżolament u l-aċidu nuklejku jiġi rilaxxat, jistgħu jseħħu interazzjonijiet bejn il-kampjun u s-soluzzjoni tal-madwar u l-fażi solida. Pereżempju, 'kenniesa' jistgħu jorbtu ma' DNA b'fergħa waħda jew doppja permezz ta' interazzjonijiet mhux kovalenti u jinterferixxu mal-iżolament u l-purifikazzjoni billi jnaqqsu n-numru ta' miri li eventwalment jilħqu l-kontenitur tar-reazzjoni tal-PCR.
B'mod ġenerali, l-inibituri tal-PCR huma preżenti fil-biċċa l-kbira tal-fluwidi tal-ġisem u r-reaġenti użati għal testijiet dijanjostiċi kliniċi (urea fl-awrina, emoglobina u eparina fid-demm), supplimenti tad-dieta (komponenti organiċi, glikoġenu, xaħam, joni Ca2+) u komponenti fl-ambjent (fenoli, metalli tqal)

Inibituri tal-PCR aktar prevalenti jistgħu jinstabu f'batterji u ċelloli ewkarjotiċi, DNA mhux fil-mira, makromolekuli li jorbtu mad-DNA ta' matriċi tat-tessuti u tagħmir tal-laboratorju bħal ingwanti u plastik. Il-purifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi waqt jew wara l-estrazzjoni hija l-metodu preferut għat-tneħħija tal-inibituri tal-PCR.
Illum, diversi tagħmir ta' estrazzjoni awtomatizzat jista' jissostitwixxi ħafna protokolli manwali, iżda qatt ma ntlaħaq irkupru u/jew purifikazzjoni ta' 100% tal-miri. Inibituri potenzjali jistgħu jkunu għadhom preżenti fl-aċidi nuklejċi purifikati jew jistgħu jkunu diġà ħadmu. Jeżistu strateġiji differenti biex jitnaqqas l-impatt tal-inibituri. L-għażla tal-polimerażi xierqa jista' jkollha impatt sinifikanti fuq l-attività tal-inibitur. Metodi oħra ppruvati biex titnaqqas l-inibizzjoni tal-PCR huma ż-żieda fil-konċentrazzjoni tal-polimerażi jew l-applikazzjoni ta' addittivi bħall-BSA.
L-inibizzjoni tar-reazzjonijiet tal-PCR tista' tiġi murija bl-użu ta' kontroll intern tal-kwalità tal-proċess (IPC).
Għandha tingħata attenzjoni biex jitneħħew ir-reaġenti kollha u soluzzjonijiet oħra fil-kit tal-estrazzjoni, bħal etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol u fenol, mill-iżolat tal-aċidu nuklejku permezz ta' stadju ta' ħasil bir-reqqa. Skont il-konċentrazzjoni tagħhom, jistgħu jattivaw jew jinibixxu l-PCR.