Fatturi ta' interferenza fir-reazzjonijiet tal-PCR

Matul ir-reazzjoni tal-PCR, spiss jiltaqgħu magħhom xi fatturi li jinterferixxu.
Minħabba s-sensittività għolja ħafna tal-PCR, il-kontaminazzjoni hija meqjusa bħala waħda mill-aktar fatturi importanti li jaffettwaw ir-riżultati tal-PCR u tista 'tipproduċi riżultati pożittivi foloz.
Ugwalment kritiċi huma s-sorsi varji li jwasslu għal riżultati negattivi foloz. Jekk parti essenzjali waħda jew aktar tat-taħlita tal-PCR jew ir-reazzjoni ta' amplifikazzjoni nnifisha jiġu inibiti jew interferiti magħhom, l-assaġġ dijanjostiku jista' jiġi mfixkel. Dan jista 'jwassal għal effiċjenza mnaqqsa u anke riżultati negattivi foloz.
Minbarra l-inibizzjoni, it-telf tal-integrità tal-aċidu nuklejku fil-mira jista' jseħħ minħabba l-kundizzjonijiet tat-tbaħħir u/jew tal-ħażna qabel il-preparazzjoni tal-kampjun. B'mod partikolari, temperaturi għoljin jew ħażna inadegwata jistgħu jwasslu għal ħsara taċ-ċelloli u l-aċidi nuklejċi. L-iffissar taċ-ċelluli u t-tessuti u l-inkorporazzjoni tal-paraffin huma kawżi magħrufa sew tal-frammentazzjoni tad-DNA u problema persistenti (ara l-Figuri 1 u 2). F'dawn il-każijiet, anki l-aħjar iżolament u purifikazzjoni mhux se jgħinu.

Figura 1 | Effett tal-immobilizzazzjoni fuq l-integrità tad-DNA
L-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose wriet li l-kwalità tad-DNA iżolata minn sezzjonijiet tal-paraffin tal-awtopsji varjat b'mod konsiderevoli. DNA ta 'tulijiet medji differenti ta' frammenti kien preżenti fl-estratti skont il-metodu ta 'fissazzjoni. Id-DNA kien ippreservat biss meta ffissat f'kampjuni ffriżati nattivi u f'formalin newtrali buffered. L-użu ta 'fissattiv Bouin aċiduż qawwi jew formalin li fih l-aċidu formiku mhux buffered irriżulta f'telf sinifikanti ta' DNA. Il-frazzjoni li jifdal hija frammentata ħafna.
Fuq ix-xellug, it-tul tal-frammenti huwa espress f'pari kilobase (kbp)

Figura 2 | Telf tal-integrità tal-miri tal-aċidu nuklejku
(a) Spazju ta' 3′-5′ fuq iż-żewġ linji se jirriżulta fi ksur fid-DNA fil-mira. sinteżi tad-DNA xorta se sseħħ fuq il-framment żgħir. Madankollu, jekk sit tal-ittemprar tal-primer ikun nieqes fuq il-framment tad-DNA, isseħħ biss amplifikazzjoni lineari. Fil-każ l-aktar favorevoli, il-frammenti jistgħu jerġgħu jissaturaw lil xulxin, iżda r-rendimenti se jkunu żgħar u taħt il-livelli ta 'skoperta.
(b) Telf ta 'bażijiet, prinċipalment minħabba depurinazzjoni u formazzjoni ta' thymidine dimer, iwassal għal tnaqqis fin-numru ta 'bonds H u tnaqqis fit-Tm. Matul il-fażi ta 'tisħin tawwalija, il-primers se jiddewweb 'il bogħod mid-DNA tal-matriċi u mhux se janneal anki taħt kundizzjonijiet inqas stretti.
(c) Il-bażijiet tat-timina maġenb jiffurmaw dimer TT.
Problema komuni oħra li ħafna drabi sseħħ fid-dijanjostika molekulari hija r-rilaxx inqas milli ottimali ta 'aċidi nuklejċi fil-mira meta mqabbla mal-estrazzjoni tal-fenol-kloroform. F'każijiet estremi, dan jista 'jkun assoċjat ma' negattivi foloz. Ħafna ħin jista 'jiġi ffrankat billi jagħli liżi jew diġestjoni enżimatika ta' debris taċ-ċelluli, iżda dan il-metodu spiss jirriżulta f'sensittività baxxa tal-PCR minħabba rilaxx insuffiċjenti ta 'aċidu nuklejku.

Inibizzjoni tal-attività tal-polimerażi waqt l-amplifikazzjoni

B'mod ġenerali, l-inibizzjoni tintuża bħala kunċett ta 'kontenitur biex tiddeskrivi l-fatturi kollha li jwasslu għal riżultati subottimali tal-PCR. F'sens strettament bijokimiku, l-inibizzjoni hija limitata għall-attività ta' l-enżima, jiġifieri, tnaqqas jew tipprevjeni l-konverżjoni ta' sottostrat-prodott permezz ta' interazzjoni mas-sit attiv tad-DNA polymerase jew il-kofattur tagħha (eż. Mg2+ għal Taq DNA polymerase).
Komponenti fil-kampjun jew diversi buffers u estratti li jkun fihom reaġenti jistgħu jinibixxu direttament l-enżima jew jonsbu l-kofatturi tagħha (eż. EDTA), u b'hekk jinattivaw il-polimerażi u mbagħad iwasslu għal tnaqqis jew riżultati negattivi foloz tal-PCR.
Madankollu, ħafna interazzjonijiet bejn il-komponenti tar-reazzjoni u l-aċidi nuklejċi li fihom il-mira huma wkoll indikati bħala 'inibituri tal-PCR'. Ladarba l-integrità taċ-ċellula tiġi mfixkla bl-iżolament u l-aċidu nuklejku jiġi rilaxxat, jistgħu jseħħu interazzjonijiet bejn il-kampjun u s-soluzzjoni tal-madwar u l-fażi solida tiegħu. Pereżempju, 'kennies' jistgħu jorbtu DNA b'linja waħda jew doppja permezz ta' interazzjonijiet mhux kovalenti u jinterferixxu mal-iżolament u l-purifikazzjoni billi jnaqqas in-numru ta' miri li eventwalment jilħqu l-kontenitur tar-reazzjoni tal-PCR.
B'mod ġenerali, l-inibituri tal-PCR huma preżenti fil-biċċa l-kbira tal-fluwidi tal-ġisem u r-reaġenti użati għal testijiet dijanjostiċi kliniċi (urea fl-awrina, emoglobina u eparina fid-demm), supplimenti tad-dieta (komponenti organiċi, glikoġenu, xaħam, joni Ca2+) u komponenti fl-ambjent (fenoli). , metalli tqal)

Inibituri PCR aktar prevalenti jistgħu jinstabu f'batterji u ċelloli ewkarjotiċi, DNA mhux fil-mira, makromolekuli li jorbtu mad-DNA ta 'matriċi tat-tessuti u tagħmir tal-laboratorju bħal ingwanti u plastiks. Il-purifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi waqt jew wara l-estrazzjoni hija l-metodu preferut għat-tneħħija tal-inibituri tal-PCR.
Illum, diversi tagħmir ta 'estrazzjoni awtomatizzat jista' jissostitwixxi ħafna protokolli manwali, iżda 100% irkupru u/jew purifikazzjoni tal-miri qatt ma nkiseb. Inibituri potenzjali jistgħu jkunu għadhom preżenti fl-aċidi nuklejċi purifikati jew jistgħu jkunu diġà daħlu fis-seħħ. Jeżistu strateġiji differenti biex jitnaqqas l-impatt tal-inibituri. L-għażla tal-polimerażi xierqa jista 'jkollha impatt sinifikanti fuq l-attività ta' l-inibitur. Metodi oħra ppruvati biex titnaqqas l-inibizzjoni tal-PCR qed iżidu l-konċentrazzjoni tal-polimerażi jew japplikaw addittivi bħal BSA.
L-inibizzjoni tar-reazzjonijiet tal-PCR tista' tintwera bl-użu tal-kontroll tal-kwalità tal-proċess intern (IPC).
Għandha tingħata attenzjoni biex jitneħħew ir-reaġenti kollha u soluzzjonijiet oħra fil-kit ta 'estrazzjoni, bħal etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol u fenol, mill-iżolat ta' l-aċidu nuklejku permezz ta 'pass ta' ħasil bir-reqqa. Skont il-konċentrazzjoni tagħhom, jistgħu jattivaw jew jinibixxu l-PCR.