Fatturi ta 'interferenza fir-reazzjonijiet tal-PCR

Matul ir-reazzjoni tal-PCR, spiss jiltaqgħu magħhom xi fatturi li jinterferixxu.
Minħabba s-sensittività għolja ħafna tal-PCR, il-kontaminazzjoni hija meqjusa bħala waħda mill-aktar fatturi importanti li jaffettwaw ir-riżultati tal-PCR u jistgħu jipproduċu riżultati pożittivi foloz.
Daqstant kritiċi huma d-diversi sorsi li jwasslu għal riżultati negattivi foloz. Jekk parti waħda jew aktar essenzjali tat-taħlita PCR jew ir-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni nnifisha huma inibiti jew interferiti, l-assaġġ dijanjostiku jista' jiġi mfixkel. Dan jista 'jwassal għal effiċjenza mnaqqsa u anke riżultati negattivi foloz.
Minbarra l-inibizzjoni, it-telf tal-integrità tal-aċidu nuklejku fil-mira jista 'jseħħ minħabba kundizzjonijiet tat-tbaħħir u / jew tal-ħażna qabel il-preparazzjoni tal-kampjun. B'mod partikolari, temperaturi għoljin jew ħażna inadegwata jistgħu jwasslu għal ħsara taċ-ċelloli u aċidi nuklejiċi. L-iffissar taċ-ċelloli u t-tessuti u l-integrazzjoni tal-paraffin huma kawżi magħrufa sew tal-frammentazzjoni tad-DNA u problema persistenti (ara l-Figuri 1 u 2). F'dawn il-każijiet, anke iżolament u purifikazzjoni ottimali ma jgħinux.

Figura 1 | Effett tal-immobilizzazzjoni fuq l-integrità tad-DNA
L-elettroforeżi tal-ġel ta 'agarose wriet li l-kwalità tad-DNA iżolata mit-taqsimiet tal-paraffin ta' l-awtopsji varjat konsiderevolment. Id-DNA ta 'tulijiet ta' frammenti medji differenti kien preżenti fl-estratti skont il-metodu ta 'fissazzjoni. Id-DNA ġie ppreservat biss meta ġie ffissat f'kampjuni ffriżati indiġeni u f'forma ta 'formalina newtrali buffered. L-użu ta 'formalin fissjattiv jew mhux imqabbad, li fih l-aċidu formiku rriżulta f'telf sinifikanti ta' DNA. Il-frazzjoni li jifdal hija frammentata ħafna.
Fuq ix-xellug, it-tul tal-frammenti huwa espress f'pari ta 'kilobase (KBP)

Figura 2 | Telf ta 'integrità ta' miri ta 'aċidu nuklejku
(a) Distakk ta '3'-5' fuq iż-żewġ linji jirriżulta f'waqfa fid-DNA fil-mira. Sintesi tad-DNA xorta se sseħħ fuq il-framment żgħir. Madankollu, jekk sit ta 'ttremprar tal-primer huwa nieqes fuq il-framment tad-DNA, isseħħ biss amplifikazzjoni lineari. Fil-każ l-iktar favorevoli, il-frammenti jistgħu jerġgħu jitrattaw lil xulxin, iżda r-rendiment se jkun żgħir u taħt il-livelli ta 'skoperta.
(B) Telf ta 'bażijiet, l-aktar minħabba d-depurizzjoni u l-formazzjoni tad-dimer tat-timidina, iwassal għal tnaqqis fin-numru ta' bonds H u tnaqqis fit-TM. Matul il-fażi ta 'tisħin tawwalija, il-primer se jdub' il bogħod mid-DNA tal-matriċi u mhux se jivvjaġġa anke f'kundizzjonijiet inqas stretti.
(c) Il-bażijiet tat-timina li jmissu magħhom jiffurmaw dimer TT.
Problema komuni oħra li ħafna drabi sseħħ fid-dijanjostika molekulari hija r-rilaxx inqas minn ottimali ta 'aċidi nuklejiċi fil-mira meta mqabbla ma' l-estrazzjoni tal-fenol-kloroform. F'każijiet estremi, dan jista 'jkun assoċjat ma' negattivi foloz. Ħafna ħin jista 'jiġi ffrankat permezz ta' lisi jagħli jew diġestjoni enżimatika ta 'debris taċ-ċelluli, iżda dan il-metodu spiss jirriżulta f'sensittività baxxa ta' PCR minħabba rilaxx insuffiċjenti ta 'aċidu nuklejiku.

Inibizzjoni ta 'attività ta' polimerażi waqt l-amplifikazzjoni

B'mod ġenerali, inibizzjoni tintuża bħala kunċett ta 'kontejner biex tiddeskrivi l-fatturi kollha li jwasslu għal riżultati ta' PCR mhux ottimali. F'sens strettament bijokimiku, l-inibizzjoni hija limitata għall-attività ta 'l-enzima, jiġifieri, tnaqqas jew tipprevjeni l-konverżjoni ta' prodott ta 'sottostrat permezz ta' interazzjoni mas-sit attiv tad-DNA polimerażi jew il-kofattur tagħha (EG, MG2 + għal DNA Polymerase TAQ).
Komponenti fil-kampjun jew diversi buffers u estratti li fihom reaġenti jistgħu jinibixxu direttament l-enzima jew jaqbdu l-kofatturi tagħha (EG EDTA), u b'hekk inattivaw il-polimerażi u mbagħad iwasslu għal tnaqqis fil-PCR negattiv jew falz.
Madankollu, ħafna interazzjonijiet bejn il-komponenti ta 'reazzjoni u l-aċidi nuklejiċi li fihom il-mira huma wkoll magħżula bħala' inibituri tal-PCR '. Ladarba l-integrità taċ-ċellula tiġi mħarbta mill-iżolament u l-aċidu nuklejku jiġi rilaxxat, jistgħu jseħħu interazzjonijiet bejn il-kampjun u s-soluzzjoni tal-madwar u l-fażi solida. Pereżempju, "scavengers" jistgħu jorbtu DNA singolu jew doppju permezz ta 'interazzjonijiet mhux kovalenti u jinterferixxu ma' l-iżolament u l-purifikazzjoni billi jnaqqsu n-numru ta 'miri li eventwalment jilħqu l-bastiment ta' reazzjoni PCR.
B'mod ġenerali, l-inibituri tal-PCR huma preżenti fil-biċċa l-kbira tal-fluwidi tal-ġisem u r-reaġenti użati għal testijiet dijanjostiċi kliniċi (urea fl-awrina, emoglobina u heparin fid-demm), supplimenti tad-dieta (komponenti organiċi, glycogen, xaħam, jonji CA2 +) u komponenti fl-ambjent (fenoli, metalli tqal)

Inibituri aktar prevalenti tal-PCR jistgħu jinstabu f'batterji u ċelloli ewkarjotiċi, DNA mhux immirati, makromolekuli li jorbtu d-DNA ta 'matriċi tat-tessuti u tagħmir tal-laboratorju bħal ingwanti u plastik. Il-purifikazzjoni ta 'aċidi nuklejiċi matul jew wara l-estrazzjoni hija l-metodu preferut għat-tneħħija ta' inibituri ta 'PCR.
Illum, diversi tagħmir awtomatiku ta 'estrazzjoni jista' jissostitwixxi ħafna protokolli manwali, iżda 100% irkupru u / jew purifikazzjoni tal-miri qatt ma nkisbu. Inibituri potenzjali jistgħu jkunu għadhom preżenti fl-aċidi nuklejiċi purifikati jew jistgħu jkunu diġà daħlu fis-seħħ. Jeżistu strateġiji differenti biex jitnaqqas l-impatt tal-inibituri. L-għażla tal-polimerażi xierqa jista 'jkollha impatt sinifikanti fuq l-attività ta' inibitur. Metodi oħra ppruvati biex titnaqqas l-inibizzjoni tal-PCR huma ż-żieda tal-konċentrazzjoni tal-polimerażi jew l-applikazzjoni ta 'addittivi bħal BSA.
L-inibizzjoni tar-reazzjonijiet tal-PCR tista 'tintwera bl-użu tal-kontroll tal-proċess tal-proċess intern (IPC).
Għandha tingħata attenzjoni biex jitneħħew ir-reaġenti kollha u soluzzjonijiet oħra fil-kit ta 'estrazzjoni, bħal etanol, EDTA, Cetab, Licl, GUSCN, SDS, isopropanol u fenol, mill-aċidu nuklejiku iżolat permezz ta' pass bir-reqqa ta 'ħasil. Jiddependi fuq il-konċentrazzjoni tagħhom, huma jistgħu jattivaw jew jinibixxu l-PCR.